一種快速鑒定RNA質(zhì)量的方法

　　隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展及在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的普及，以RNA為研究對(duì)象的實(shí)驗(yàn)與日俱增。RNA質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成敗。Northern印跡雜交分析、寡聚(Oligdt) 纖維素選擇分離mRNA、cDNA合成及體外翻譯等實(shí)驗(yàn)的成敗，在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。因此在進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)之前對(duì)RNA的質(zhì)量進(jìn)行快速可靠的鑒定就十分必要。目前RNA 的質(zhì)量采用變性瓊脂糖凝膠電泳方法來(lái)鑒定，這些方法步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。我室在長(zhǎng)期進(jìn)行RNA的研究中，摸索出了一套穩(wěn)定、快速和可靠的鑒定RNA質(zhì)量的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

　　1.材料與方法

　　1.1.主要試劑：提取RNA的TriPure Isolation Reagent試劑盒、DEPC，常規(guī)試劑如瓊脂糖等為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)AR級(jí)以上。

　　1.2.RNA的提取：以人胎盤組織提取總RNA，方法按TriPure Isolation Reagent試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。對(duì)提取的RNA在紫外分光光度計(jì)上測(cè)A260值和A260/ A280比值，確定所提取RNA 的濃度和純度。

　　1.3.RNA的瓊脂糖凝膠電泳：電泳方法、步驟大體同文獻(xiàn)中的瓊脂糖凝膠電泳。為最大限度降低RNA在電泳時(shí)被降解，結(jié)合甲醛變性瓊脂凝膠電泳分離RNA方法，在常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳的基礎(chǔ)上進(jìn)行如下改進(jìn)。①電泳RNA所用器械如制膠的模具、梳子、電泳槽等用肥皂粉洗干凈后用雙蒸水沖洗二遍后在室溫晾干備用。②用新的1XTBE配制1.2%瓊脂糖凝膠，倒膠時(shí)溴化乙錠(EB)直接加入凝膠中。③制備好的瓊脂糖凝膠板放入電泳槽后再加入經(jīng)高壓滅菌過的1XTBE，液面只能剛好同膠面平齊，緩沖液不要淹過膠面。④點(diǎn)樣時(shí)，樣品RNA每10μl加入2μl上樣緩沖液，上樣緩沖液是用DEPC處理的水配制的50 %甘油，另外單獨(dú)點(diǎn)一樣品孔含有3μl溴酚藍(lán)的上樣緩沖液作為電泳指示劑，電泳電壓4V/cm，電泳時(shí)間2h左右便可取出凝膠在紫外燈下觀看所提取的RNA的質(zhì)量或進(jìn)行拍照記錄。

　　2.結(jié)果：取人胎盤組織RNA3μg和6μg，按本方法以1.2 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可見28S、18S、5.8S(5S)三條清晰的rRNA條帶。

　　3.討論：RNA作為分子生物學(xué)的主要研究對(duì)象之一，但它極易受到RNase的水解，在進(jìn)行RNA操作時(shí)主要是避免外源RNase的污染，特別是在得到RNA沉淀以后，無(wú)RNase抑制劑存在的條件下尤其如此。因此，在RNA操作過程中必須對(duì)所有實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行徹底的處理，滅活RNase，如EP管、Tip頭等；另外，有一個(gè)良好的操作環(huán)境也是非常的重要。

RNA質(zhì)量如何、是否被降解通常采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳方法來(lái)鑒定。此電泳的主要目的之一是為了Northern blot之用。但在RNA的其他用途中，如cDNA合成和寡聚(OligdT) 纖維素選擇分離mRNA等實(shí)驗(yàn)中要對(duì)RNA進(jìn)行質(zhì)量鑒定，此方法就現(xiàn)得繁瑣、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳RNA會(huì)水解而達(dá)不到鑒定的目的，如果用本研究改進(jìn)的1.2 %瓊脂糖凝膠方法電泳鑒定，簡(jiǎn)單、高效、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，并且能達(dá)到同用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此本方法在常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳的基礎(chǔ)上所作的每一項(xiàng)改進(jìn)均是為了避免RNA在電泳過程中被水解，比如對(duì)所有電泳器具徹底的清洗處理就是為了盡量清除器具上存在的RNase；在RNA樣品中加入用DEPC水配制的50%甘油作為上樣緩沖液，目的也是為了在RNA樣品中避免加入其他試劑時(shí)造成RNase的污染。

　　在提取的真核細(xì)胞總RNA中核糖體RNA(rRNA)是28S清晰的帶型，通常認(rèn)為所提取的RNA 未被降解，可以用提取的RNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。我們實(shí)驗(yàn)室還提取過多種組織RNA如外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后的RNA、脂肪組織RNA、肝臟RNA等，經(jīng)此方法鑒定的RNA的質(zhì)量同分子克隆手冊(cè)等參考書用變性瓊脂糖凝膠鑒定的RNA完全無(wú)異，結(jié)果穩(wěn)定可靠。占總RNA 的90%以上，它們主要由28S、18 S、5.8 S、5S組成，28S(約4.5 kb)、18S(約2.1kb)、5.8S(5S) 這三類rRNA的摩爾濃度大致相等，但他們的分子量相差較大，在紫外燈下的亮度依次為28S>18S>5.8S(5S)。在電泳后能觀察到28S、18S、5.8 S(5S) ，特別是28S清晰的帶型，通常認(rèn)為所提取的RNA未被降解，可以用提取的RNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。我們實(shí)驗(yàn)室還提取過多種組織RNA如外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后的RNA、脂肪組織RNA、肝臟RNA等，經(jīng)此方法鑒定的RNA的質(zhì)量同分子克隆手冊(cè)等參考書用變性瓊脂糖凝膠鑒定的RNA完全無(wú)異，結(jié)果穩(wěn)定可靠。