原代肝細(xì)胞分離方法

　　體外培養(yǎng)肝細(xì)胞的關(guān)鍵是如何分離得到形態(tài)完整、體外代謝活性高的肝細(xì)胞. 自1953年Anderson[2]首創(chuàng)剪切法從肝臟分離肝細(xì)胞以來, 各實(shí)驗(yàn)室對(duì)肝細(xì)胞的分離方法進(jìn)行了不斷改進(jìn). 在眾多方法中, 主要分為非灌流的方法和灌流的方法.

　　1.1 采用非灌流的方法

　　早期的研究一般通過非灌流這種簡單的步驟分離肝細(xì)胞.

　　1.1.1 機(jī)械分離法:

　　機(jī)械分離法是利用機(jī)械剪切及強(qiáng)力吹打等物理手段來分離肝細(xì)胞的方法[3]. 張頂 et al[4]在分離樹鼩肝細(xì)胞的過程中, 首先將樹鼩的肝臟剪成小塊, 然后通過擠壓、剪碎和震蕩等機(jī)械手段, 使肝細(xì)胞從肝組織上脫落, 從而獲得互相分離的肝細(xì)胞.

　　1.1.2 胰酶消化法:

　　胰酶消化法是利用胰酶來破壞肝細(xì)胞之間的橋連, 使肝細(xì)胞分離的一種方法. Dulbecco et al[5]首次采用胰酶來分離猴腎細(xì)胞、大鼠肝細(xì)胞, 并運(yùn)用到體外細(xì)胞的研究和培養(yǎng)中. 劉友平 et al[6]利用該方法分離肝細(xì)胞時(shí), 首先取出小鼠的肝組織用眼科剪剪碎至糊狀, 然后用緩沖液充分清洗并加入胰酶進(jìn)行消化. 待消化完全后用D-Hank’s液清洗, 最后加入含有血清的培養(yǎng)液終止胰酶的作用, 得到消化徹底的細(xì)胞懸液.

　　1.1.3 膠原酶消化法:

　　膠原酶消化法是利用膠原酶來破壞細(xì)胞間的纖維成分, 使肝細(xì)胞分離的一種方法. 王琳 et al[7]在利用該方法分離新生小鼠肝細(xì)胞時(shí), 首先將新生小鼠的肝臟剪成1 mm3組織塊, 用無鈣無鎂的D-Hank’s液反復(fù)沖洗后加入膠原酶進(jìn)行消化. 最后用DMEM液終止膠原酶的作用, 得到肝細(xì)胞懸液.

　　1.2 采用灌流的方法

　　雖然非灌流的方法以其簡單易行的特點(diǎn)得到了一定的應(yīng)用, 但由于存在消化不完全、分離得到的肝細(xì)胞中多細(xì)胞團(tuán)塊存在的問題, 不能滿足許多基礎(chǔ)研究或臨床應(yīng)用的要求. 1969年, Berry和Friend[8]引入了肝臟灌流法, 灌流可以使消化液與肝組織更加充分地接觸, 不僅提高了分離效率, 還使分離所得肝細(xì)胞的活力和數(shù)量大大提高.

　　1.2.1 離體膠原酶灌流法:

　　離體膠原酶灌流法是將離體灌注與膠原酶消化相結(jié)合的方法. 在使用該方法分離肝細(xì)胞時(shí), 首先將動(dòng)物肝臟取出, 于門靜脈內(nèi)置管或直接在獲得的肝組織塊的血管或切口內(nèi)置管, 用預(yù)熱的無鈣無鎂的D-Hank’s液灌流. 然后換用膠原酶作持續(xù)灌流, 使肝細(xì)胞與間質(zhì)分離. 最后用培養(yǎng)液終止膠原酶的消化作用, 過濾、離心、棄上清后得到肝細(xì)胞懸液.

　　1.2.2 Seglen兩步灌流法(原位膠原酶灌注法):

　　自從引入灌流法分離肝細(xì)胞以來, 許多學(xué)者根據(jù)不同的應(yīng)用條件對(duì)灌流法進(jìn)行了改良. 其中Seglen[10]經(jīng)過一系列細(xì)致的研究, 創(chuàng)立了改良的Seglen兩步灌流法, 這一方法已成為應(yīng)用至今的標(biāo)準(zhǔn)的原代肝細(xì)胞分離方法. 兩步灌流法主要是通過門靜脈先后用含EDTA或EGTA緩沖液和膠原酶緩沖液進(jìn)行灌注來分離肝細(xì)胞的方法. 許多學(xué)者在具體操作中, 不斷改進(jìn)兩步灌流法的灌注條件, 目的在于進(jìn)一步減少分離過程中肝細(xì)胞的損傷, 提高肝細(xì)胞的活率.

　　1.2.3 半原位膠原酶灌流法:

　　半原位膠原酶灌流法是我國學(xué)者彭齊容 et al[13]以Seglen法為基礎(chǔ)建立的肝細(xì)胞分離技術(shù). 俞紅 et al[14]在采用該方法分離乳豬肝細(xì)胞時(shí), 首先用無鈣無鎂的D-Hank’s液于門靜脈進(jìn)行原位灌注. 接著, 除保留門靜脈以外, 離斷肝臟血管并將肝臟移入無菌平皿中, 繼續(xù)用膠原酶進(jìn)行灌注使肝細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞分離. 最后鈍性撕裂組織, 過濾洗滌后得到制備好的細(xì)胞懸液.

　　1.2.4 下腔靜脈插管的逆向膠原酶灌注法:

　　下腔靜脈插管的逆向膠原酶灌注法是在肝下腔靜脈插管, 并結(jié)合逆向膠原酶灌注來分離肝細(xì)胞的方法[9]. 在采用該方法分離肝細(xì)胞時(shí), 首先將灌注針逆向插入下腔靜脈后固定, 門靜脈開放做流出道. 接著用含EGTA或EDTA的灌注液進(jìn)行灌注, 一段時(shí)間后再用含有Ca2+的膠原酶進(jìn)行充分灌注. 灌流結(jié)束后, 將細(xì)胞過濾、清洗后得到制備好的肝細(xì)胞懸液.

　　1.2.5 Gerlach五步膠原酶灌流法:

　　在使用兩步灌流法分離大的肝組織塊時(shí), 仍存在消化不完全的問題. 而Gerlach et al[15]在兩步灌流法的基礎(chǔ)上, 創(chuàng)立了聯(lián)合門靜脈和肝動(dòng)脈的五步膠原酶灌流技術(shù), 建立了一種高效的細(xì)胞分離方法.